如何有效完成CRISPR實驗！

生物學家們總是沉迷于對基因組修修補補，而其中一種近期紅得發(fā)紫的技術就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 作為一種基因組編輯工具登臺以來，關于這種技術的論文數量就大幅增加，的證明之一就是2015年兩位科學家由于在CRISPR基因組編輯技術方面的重要貢獻而獲得“科學突破獎”，其中一位獲獎者：Jennifer Doudna zui近在范德堡大學進行客座演講，主會場和分會場都擠滿了人，從中可以窺見這一技術的火熱程度。

CRISPR全稱為clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于細菌及古細菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點特異性的RNA指導Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。直到近年，科學家們才開始利用這一系統(tǒng)在活體動物基因組中生成靶向突變，刪除原有的基因或插入新基因。

這一技術發(fā)展迅速，就在去年，研究人員已經發(fā)現(xiàn)了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一種罕見肝臟疾病的方法，并且科學家們也發(fā)現(xiàn)可以通過這種方法切除人類免疫細胞中hiv病毒插入的基因，阻止HIV進入血液干細胞。其原因可能在于這種方法比其它基于核酸酶的編輯方法操作簡便，研究人員跟著指南操作，進行一輪PCR就能基本完成CRISPR實驗了。

但CRISPR/Cas系統(tǒng)也存在自身的一些缺陷，比如進入細胞后，有可能在非目標位點進行酶切，從而導致脫靶，這對于臨床應用來說是一大敗筆。

我們需要更加和有效的CRISPR工具，研究人員也正在研究如何避免這類情況的發(fā)生，開發(fā)更好的預測編輯工具，或者研發(fā)能將CRISPR元件更有效傳遞到細胞內的方式，以下是the scientist雜志匯總的新進展。

癌癥研究的啟示

研究者：康奈爾大學遺傳學教授John Schimenti

項目：利用 CRISPR/Cas9 研發(fā)癌癥和減數分裂小鼠模型

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過在基因組上造成切口來完成編輯工作，這些切口可以通過兩種途徑修復，一種是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 過程進行粘合，這種方法有效但容易出錯;另外一種方法就是加入包含目標突變的DNA人工片段，利用同源指導修復(homology-directed repair，HDR，編者譯)完成。

Schimenti 說，“問題在于這兩個過程是競爭完成的。前者NHEJ會由于實驗小鼠出現(xiàn)非目標突變受到干擾，”他們希望能找到一種HDR途徑新方法完成有效，且更的編輯，

為了解決這一問題，研究人員嘗試針對過去的果蠅胚胎基因組編輯實驗改進 HDR/NHEJ 比例，他們通過遺傳手段抑制了NHEJ途徑中的一個分子：DNA連接酶IV，碰巧正好有這么一個小分子抑制劑，SCR7能抑制這種酶的作用(這種小分子在之后的實驗中被證明能作為癌癥治療分子)。

Schimenti研究組在小鼠胚胎中改變了一個基因的兩個堿基，結果證明加入SCR7能將HDR:NHEJ比率從之前的1:10調整為1:2.5，這一研究成果公布在今年的Genetics雜志上，標題為A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。

如何操作：

只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的單細胞受精卵之后，在培養(yǎng)基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究組，如范德堡大學的Douglas Mortlock也在嘗試進行這一實驗。Schimenti實驗室常會在實驗中加入這種物質，因為目前看來SCR7并不會造成什么傷害，不過“這種小分子確實會影響其它基因，所以還是需要進行對比實驗，”他說。

注意事項：

培養(yǎng)基中加入了SCR7(50 μ M)的受精卵生存率更高，但是在two-cell階段，SCR7 會影響細胞進入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示這應該不成問題，因為在那之前就可以將其轉入到雌性小鼠中了。

成本：從Xcessbio公司可以買到SCR7，價格為129 美元/2 mg(當地價格)。

人體細胞中的可誘導CRISPR

研究者：紀念斯隆凱特琳癌癥中心干細胞生物學中心的發(fā)育生物學家Danwei Huangfu

研究項目：利用人類胚胎干細胞了解胰腺發(fā)育過程中特殊基因的作用和相互影響 CRISPR/Cas工具的一大挑戰(zhàn)就是將這一系統(tǒng)中的元件傳輸到細胞內，通常這是通過電穿孔完成，但是將 CRISPR/Cas系統(tǒng)插入到人類干細胞中的這一過程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一個單一突變傳送，需 要一個月的時間。

Huangfu的項目要求刪除一個或多個基因的兩個拷貝，這也就意味著多輪靶定，她需要一個效率更高的系統(tǒng)。

要解決這個問題，zui困難的一步是將大體積的Cas9 基因傳入到細胞內，為此Huangfu研究組構建了一種已經整 合了Cas9元件的細胞系：首先他們采用了一種相似的技術TALEN，這種技術與CRISPR技術的不同之處在于，前者采用的是DNA結合位點，后者才有的是導向RNAs(An iCRISPR platform for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in human pluripotent stem cells)。

“通過TALENs，我們將 Cas9 整合到了人類干細胞上的一個非常特殊的位點，這一位點不易發(fā)生沉默效應。”

研究人員還設計了能在藥物多西環(huán)素存在的條件下表達 Cas9 的細胞。這種方法被稱為iCRISPR，研究人員能 利用iCRISPR在分化過程中不同時間點里打開基因組編輯。(注意不要將iCRISPR與CRISPRi弄混淆了，后者與RNAi相似，能可逆性的阻止轉錄)

iCRISPR技術能將CRISPR/Cas操作主要步驟縮減成一個：用導向RNA轉染細胞，導向RNA要小得多，也更容易進 入細胞。“我們驚訝的發(fā)現(xiàn)(iCRISPR)作用非常好，”Huangfu說，利用這一技術，她的研究組在一個月的時 間里完成了12個基因的突變。

如何操作：

Huangfu研究組公布了這一技術的詳細步驟(The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells)，如果已經有了一些人類干細胞基因靶向的實驗經驗，研究人員可以從Addgene 公 司購買質粒，自己構建iCas9 表達的細胞。如果材料齊全，那么一到兩個月時間就能構建出 iCas9 細胞，再用接下來的一兩個月時間完成基因組編輯細胞系。 如果不想從頭制作 iCas9 細胞，那么可以SKI Stem Cell Research Facility。

注意事項：

雖然Huangfu研究組目前還未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶效應，但是這一研究組采用了兩種措施來避免潛在的脫靶(類似 于RNAi實驗)：恢復實驗(rescue experiments，生物通譯)和用兩個不同的 CRISPRs 靶向相同基因。

成本：Addgene質粒成本為$65(當地價格)，iCas9 細胞構建需要$600，SKI購買需要400美元。

新傳送方式

研究者：哈佛大學化學與化學生物學教授David Liu

項目：在小鼠模型中尋找治療遺傳性耳聾的方法

基因組編輯蛋白需要進入靶向細胞核中完成任務，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一樣，傳遞是一個主 要問題。

而且如果 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是作為DNA質粒傳遞進入的話，Cas9 核酸酶作用會增強，不僅會切斷靶向基因， 而且還會影響其周圍的基因，導致脫靶編輯。

為了解決這一問題，Liu等人模擬了科學家們將DNA和RNA一類的核酸傳送至細胞中去的方式。這一系統(tǒng)依賴于 稱作為陽離子脂質的正電荷分子，其能夠結合負電荷核酸形成脂質體。脂質體一旦形成，其可通過至少兩種方 式將內容物傳遞到細胞中。在某些情況下，脂質體有可能與細胞膜融合釋放它的貨物。此外，脂質體還可能與 核內體膜融合釋放出內容物。

“我們有一個非常簡單的想法，即將研究人員用來傳送DNA和RNA的商業(yè)化陽離子脂質用于傳送蛋白質。這次我 們沒有采用超正電荷蛋白，而是利用了超負電荷蛋白，其類似于核酸處于高度的負電荷狀態(tài)。利用陽離子脂質 來傳送與高度負電荷分子結合的蛋白質，相比于采用正電荷蛋白質或肽來傳送蛋白質其效力提高了近1000 倍，”Liu說。

zui終實驗證實了利用這一新系統(tǒng)來傳送基因組編輯蛋白質，至少與傳送編碼基因組編輯蛋白的DNA所觀察到的 結果一樣。而且傳送蛋白比傳送DNA的基因組編輯特異性要高得多。

傳送DNA之后，在長時間內難以控制編碼蛋白的表達量。DNA傳送與期望的基因組編輯結果之間總是無法一致。在基因組編輯中，其任務是修復一個或兩個拷貝的基因。而在基因組編輯蛋白完成這一任務后，你會想讓它消 失，因為在此之后它所做的就是不希望發(fā)生并有可能是有害的事情。

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